Eelectroforesis de hemoglobina.
Introducción:
La electroforesis es una técnica analítica que sirve para separar las moléculas en función de su carga eléctrica neta.
Cuando se aplica una corriente eléctrica a un medio electrolítico que contiene moléculas cargadas, las moléculas cargadas negativamente (aniones) se desplazan hacia el electrodo positivo (ánodo), y las cargadas positivamente (cationes) se desplazan hacia el electrodo negativo (cátodo).
Las proteinas son moléculas anfóteras, es decir, pueden estar cargadas positiva o negativamente o no estarlo, según el pH del medio en el que se encuentran.
Así, cuando el pH del medio que circunda las proteínas es neutro, éstas se comportan como partículas no cargadas. Sin embargo, si el pH del medio que las rodea es ácido, las proteínas adquieren una carga eléctrica neta positiva. Y por el contrario, cuando el pH es básico ( o alcalino), las proteínas se cargan negativamente.
Material:
-Tiras de cellogel.
-Aplicador de electroforesis semimicro.
-Rodillo.
-Bandejas.
-Fuente de alimentación/cubeta/puente.
-Placa de vidrio.
-Tubos de ensayo milimetrados.
-Papel parafilm.
-Centrifugadora.
-Pipetas pasteur graduadas.
-Agitador de tubos.
Muestra:
- Sangre hemolizada preparada.
Reactivos:
-Suero fisiológico a 0,9%.
-Agua destilada.
-Solución decolorante: solución ácido acetico 5%.
-Solución transparentadora de electroforesis (metanol, ciclohexanona, ac acetico glacial).
-Cloroformo.
-Metanol.
-Tampón o buffer Tris-hippurate.
-Colorante negro amido o en su defecto rojo punceau.
Fundamento:
La carga eléctrica global de la hemoglobina es la resultante de la suma de las cargas de los aminoácidos que constituyen las cadenas polipeptídicas de su globina.
En la electroforeis de hemoglonina, el hemolizado se deposita sobre un soporte preparado en un líquido alcalino y se aplica una corriente eléctrica que lo atraviesa.
Como las cadenas polipéptidicas de la globina en medio básico adquieren una carga negativa, la hemoglobina se va desplazando progresivamente hacia el ánodo.
Pero en la sangre hay varios tipos de hemoglobina y cada una de ellas adquiere la carga eléctrica de una forma más o menos intensa. Así las más electronegativas avanzan más rápidamente hacia el ánodo y las menos lo hacen más lentamente.
Al cabo de un tiempo, las moléculas de Hb idénticas se agrupan entre sí y adoptan el aspecto de bandas.
Cada banda está constituida por un tipo diferente de Hb y se separa del resto debido a su distinta carga eléctrica neta y, por consiguiente, a su diferente capacidad de migración.
Procedimiento:
Esta práctica se compone de dos grandes pasos:
1. Preparación de la muestra (Hemolizado):
-Vertir 3ml de sangre anticoagulada en un tubo de cristal de centrífuga graduado.
-Centrifugar a 3000rpm durante 10 minutos (En realidad serían 5´pero para asegurar...).
-Retirar el sobrenadante y resuspender (mezclar) con suero salino(4-5ml) y centrifugar a 3000rpm durante 5 minutos. Repetir este proceso 3 veces.(En total serían 4 lavados).
-En el último lavado, quitamos el sobrenadante y le vertimos 1/2 de volumen de cloroformo y 1,5 volúmenes de agua destilada. (Ejemplo: 1ml de sangresedimentada+0,5ml de cloroformo+ 1,5ml de sangre.
-Agitar el tubo en el agitador de tubos vibratorio y centrifugar a 3000rpm durante 20 minutos.
-Obtendremos tres capas, hemolizado con Hb, restos celulares y cloroformo.
-Coger el sobrenadante (bemolizado) que será nuestra muestra.
2. Electroforesis:
-Marcar las tiras con lápiz en un extremo, para llevar una referencia de dónde comienza la partida de la electroforesis de la hemoglobina.-Empaparlas durante diez minutos en tampón pH=8,8.
-Secar las tiras con papel de filtro y montar el puente, poner la cara absorbente (esquina recortada hacia el lado inferior derecho) hacia arriba, los dos extremos de la tira deben tocar la solución tamponadora.
-Colocar de manera que la electroforesis se realice del lado negativo al positivo (del negro al rojo).
-Poner una fina raya de muestra cerca de la marca realizada.
-Conectar la fuente de poder y mantener la corriente a 400v durante 15 minutos.
-Coger las tiras e introducir la cara absorbente en una cubeta con colorante negro amido o en su defecto rojo punceau durante 10 minutos.
-Introducir en otra cubeta con solución decolorante de ácido acético durante 10 minutos, repetir este proceso 3 veces o las veces necesarias.
-Introducir las tiras en una cubeta con metanol durante 1 minuto.
-Transparentar las tiras con solución transparentadora entre 2 y 3 minutos.
-Por último, estirar las tiras con un rodillo y una placa y secar las tiras en la estufa entre 5 y 6 minutos.
Lectura de los resultados
-Al realizar esta práctica dos veces en clase, nos hemos percatado de varios errores, como por ejemplo la ausencia de un dispensador de sangre en la tira o el tener que diluir la solución decolorante ya que era muy fuerte para las tiras.
