Práctica 26: Determinación de hemoglobina en sangre.(PXVII) (B3)

Fecha: 19-1-15

Determinación de hemoglobina en sangre.

Introducción:

La determinación de la hemoglobina en sangre es un paso fundamental en el diagnóstico de las anemias. Existen varios métodos para su determinación. Los más utilizados se fundamentan en la capacidad para absorber luz de la hemoglobina o alguno de sus derivados, como la cianmetahemoglobina.

Material:

-Tubos de ensayo.

-Pipetas graduadas y prepipetas.

-Espectrofotómetro.

-Cubetas de espectrofotómetro.

-Matraz aforado.

-Papel y lápiz.

-Micropipeta
-Rotulador permanente.

Muestra:

-Dos muestras de sangre capilar o venosa anticoagulada con EDTA, heparina u oxalato.

Reactivos:

-Agua destilada.

-Cianuro de potásio.

-Patrón de hemoglobina ]Hb]=15g/dl

Fundamento:

-Esta práctica se basa en la transformación de hemoglobina en  cianmetahemoglobina.

Procedimiento:

1. Preparar el reactivo de trabajo o blanco:
      -Coger 5ml de cianuro de potasio y depositarlos en una matraz aforado de 250ml y enrasar con agua destilada.

2. Preparar los patrones de hemoglobina para el espectrofotómetro realizando una disolución seriada:
      -Coger 250microlitros de patrón y depositarlos en un tubo de ensayo. [Hb]=15g/dl.
      -Coger 250microlitros de patrón y depositarlos en un tubo de ensayo y mezclarlos con 250microlitros de agua destilada(disolución 1/2).[Hb]=7,5g/dl.
      -Coger del segundo patrón 250microlitros y depositarlos en un tubo de ensayo y mezclarlos con 250microlitros de agua destilada(Disolución 1/4).[Hb]=3.75g/dl.

3. Calibrar el espectrofotómetro con agua destilada y calcular las absorbancias de los patrones.

4. Realizar el método micro:
      -1º Tubo de ensayo: 2,5 ml de reactivo de trabajo o blanco.
      -2º Tubo de ensayo: 2,5 ml de blanco y 10microlitros de patrón.[Hb]=15g/dl.
      -3º Tubo de ensayo: 2,5 ml de blanco y 10microlitros de muestra 1.
      -4º Tubo de ensayo: 2,5 ml de blanco y 10microlitros de muestra 2.

5. Calcular las absorbancias:
     -1º: Calcular absorbancia de blanco (Primer tubo de ensayo).
     -2º: Calcular absorbancia  de patrón (Segundo tubo de ensayo).
     -3º: Calcular absorbancia de primera muestra problema (Tercer tubo de ensayo).
     -4º: Calcular absorbancia de segunda muestra problema (Cuarto tubo de ensayo).

6. A partir de estas absorbancias, calcular la concentración de hemoglobina de las dos muestras problema, realizando una gráfica.

Interpretación de los resultados:

-Patrón 1:

   -[Hb]=15g/dl.

   -A540=0.136.

-Patrón 2:

   -[Hb]=7,5g/dl.

   -A540=0,069.

-Patrón 3:

   -[Hb]=3.75g/dl.

   -A540=0,056.

-Muestra problema 1:

   -[Hb]=?

   -A540=0,177.

-Muestra problema 2:

   -[Hb]=?

   -A540=0,114.

(Perdonad la calidad :S)

(Clíca en la imagen para amplicar)

La primera muestra problema nos da de concentración 19,5 g/dL y la segunda muestra problema da 12,5 g/dL.

También para calcular la concentración sin una gráfica, se puede utilizar una fórmula o regla de tres:

(ABS muestra/ABS patrón) x 15(concentración del patrón= g/dL

Muestra 1: (0,177/0,136)x15= 19,5 g/dL
Muestra 2: (0,114/0,136)x15= 12,5 g/dL