Práctica 31: Prueba de la sacarosa. (PXXV)(B3).

Fecha: 26-02-15

Prueba de la sacarosa.

Introducción:

La prueba e la sacarosa consiste en situar los hematíes problema en un medio de baja fuerza iónica. En este medio, los eritrocitos tienden a fijar el complemento, por lo que cuando los glóbulos rojos presentes en la muestra tienen una sensibilidad anormalmente alta al complemento, tienden a sufrir la acción de éste y a lisarse.

Material:

-Pipetas pasteur.

-Micropipetas grauadas de 100 y 200 microlitros.

-Pipetas graduadas de 2 y 5 ml.

-Tubos de centrífuga.

-Un reloj.

-Una centrífuga.

-Un espectrofotómetro.

-Una gradilla.

-Rotulador de vidrio.

-Una báscula.

-Matraz de 100ml

-Un vidrio de reloj.

-Una varilla.

-Una cucharilla de metal.

-Vasos de precipitado.

Reactivos:

-Agua destilada.

-Solución acuosa de sacarosa 9,24%.

-Sangre control (Sangre recién extraida la cual sabemos que no presenta hemólisis).

-Suero fisiológico 0,9%.

-Solución acuosa de amoniaco 1/6.

Muestra:

-Sangre venosa anticoagulada con EDTA.

Fundamento:

Con esta prueba podremos determinar si nuestra sangre problema presenta hemoglobinuria paroxistica nocturna.

Proceimiento:

1. Preparar solución acuosa de amoniaco 1/6:

-1/6=X/100; X= 16,67 g de soluto.

-100g-16,67= 83,33g de disolvente.

2. Preparar solución acuosa de sacarosa 9,24%:

-Pesar 9,24g de sacarosa y disolver en 100ml de agua destilada.

3.Rotular tres tubos:

-1º: SF; Suero fisiológico.

-2º: SC: Sangre control.

-3º: SP: Sangre problema.

4. Rellenarlos según estas indicaciones:

5. Agitar suavemente los tubos y dejar reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

6. Centrifugar los tubos a 2000rpm durante 5 minutos.

7. Rotular tres tubos:
-4º: TB; Tubo blanco.
-5º: TPr; Tubo patrón.
-6º: TPa; Tubo problema.

8. Rellenarlos según la tabla:

9. Medir la absorbancia de estos tubos en el espectrofotómetro.

Lectura de los resultados:

El resultado de las absorbancias:

-TB: ABS=0 (blanco)

-TPr: ABS= -0,052

-TPa: ABS= -0,00

Estos son los resultados de una sangre que sabemos que no tiene HPN y por eso nos dan negativos.

Aun así se puede calcular el % de hemólisis:

% de hemolisis=A(absorbancia del líquido presente en el tubo problema)/Am(absorbancia del líquido contenido en el tubo patrón (A máxima) x 100

Práctica 30: Estudio de la fragilidad osmótica de los hematíes. (PXXIV)(B3).

Fecha: 25-2-15

Estudio de la fragilidad osmótica de los hematíes.

Introducción:

Una de las funciones de la membrana plasmática de las células es:

Una vez explicado qué es el equilibrio osmótico, entenderemos mejor el concepto de concentrado y diluido realizando esta práctica.

Material:

-Pipetas pasteur.

-Tubos de centrífuga.

-Una cetrífuga.

-Un reloj.

-Un espectrofotómetro.

-Cubetas de espectrofotómetro.

-Una gradilla.

-Tijeras y papel parafilm.

Reactivos:

-Suero fisiológico tamponado a pH fisiológico (7,4).

-Agua destilada.

Muestra:

-Sangre venosa anticoagulada con heparina.

Fundamento:

-Este estudio valora la resistencia de los eritrocitos a disoluciones de presión osmótica decreciente, en condiciones constantes de pH y temperatura. Para ello se enfrentan los hematíes problema a soluciones tamponadas de cloruro sódico cuya concentración es decreciente a partir de 9 gramos por mil.

-En condiciones normales, un eritrocito puede aceptar sin hemolizarse una entrada de agua que incremente su volumen en un 70% como máximo.

Procedimiento:

1. Preparación de suero salino tamponado:

-Como ya tenemos preparado suero fisiológico 0,9% solo le tendriamos que añadir 2,7 gramos de di-sodio hidrógeno fosfato (Na2HPO4).

2. En esta práctica trabajaremos con siete concentraciones conocidas (En realidad han sido 8 pero la absorbancia del último tubo no era la esperada). Asi que enumeramos cada tubo de centrífuga según corresponda:

En mi caso hemos seleccionado los tubos 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15 y 17

3. Vertir una gota de sangre en cada tubo de centrífuga.

4. Reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente.

5. Centrifugar a 2000rpm durante cinco minutos o dejar reposar durante 3 horas.

6. Medir las absorbancias de las muestras del menos diluido al más concentrado para no manchar ni desperdiciar pipetas pasteur y demás.

Lectura de los resultados:

Tubo 1: ABS= 0 (Blanco)

Tubo 3: ABS= 0,018.

Tubo 7: ABS= 0,153.

Tubo 9: ABS= 0,579.

Tubo 11: ABS= 0,983.

Tubo 13: ABS= 1,042.

Tubo 15: ABS= 1,099.

Tubo 17: ABS= 0, 976. (Esta muestra la hemos descartado, pues no debería de salir este resultado).

Calculamos el porcentaje de hemolisis:

% de hemólisis= A(Absorbancia del líquido presente en el tubo analizao)/Am(Absorbancia  máxima) x 100

Tubo 3: (0,018/1,099)x100=1,64 %

Tubo 7: (0,153/1,099)x100=13,92%

Tubo 9: (0,579/1,099)x100=52,68%

Tubo 11: (0,983/1,099)x100=89,44%

Tubo 13: (1,042/1,099)x100=94,81%

Tubo 15: 100%

En condiciones normales, debe apreciarse visualmente una hemólisis parcial clara a partir del tubo nº 10 y, una hemólisis prácticamente total a nivel de los tubos 12, 13 ó 14.

Generalmente el 50% de hemólisis se produce a nivel de los tubos 10 u 11.